In-vivo-Studie zur Wechselwirkung von Borophen-Nanoflocken mit dem Käfer Tenebrio molitor: Lebensfähigkeit von Hämozyten und kurz

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 11823 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die Familie der auf Graphen basierenden Materialien begrüßte 2014 ein neues Mitglied, Borophen. Forschung zu Synthesewegen und experimentelle Studien zu physikochemischen und biologischen (insbesondere in vivo) Eigenschaften sind immer noch dringend erforderlich, um ihr praktisches Potenzial als Medikamentenverabreichung zu bewerten. System. Die Wirkung zweidimensionaler Borophen-Nanoflocken auf Zellen, Systeme und den gesamten tierischen Organismus wurde bisher nicht untersucht. Daher untersuchten wir in vivo seine Biokompatibilität mit Hämozyten im Tenebrio molitor als Modellorganismus. Kurzzeitstudien zeigten, dass Borophen-Nanoflocken in Dosen von 0,5, 1 oder 2 µg Nanoflocken pro Insekt keine Hämozytotoxizität hervorriefen. Hämozyten, die Nanoflocken ausgesetzt waren, zeigten eine Morphologie, Haftfähigkeit und die Fähigkeit zur Bildung von Filopodien wie die Kontrollhämozyten. Eine detaillierte Studie zeigt, dass Borophen-Nanoflocken (i) keine intrazellulären reaktiven Sauerstoffspezies in Hämozyten erzeugen, (ii) das Mitochondrienmembranpotential beeinflussen und (iii) die Phagozytose beeinträchtigen. Daher präsentiert dieser Beitrag neue in vivo-Einblicke in die Gruppe der zweidimensionalen Materialien, die aufgrund ihrer besonderen Struktur und einzigartigen Eigenschaften zu den vielversprechendsten Materialien für biomedizinische Anwendungen zählen. Allerdings sind noch Langzeitstudien an Insekten und anderen Tieren erforderlich, um zu bestätigen, dass Borophen biokompatibel und biologisch sicher ist.

Die Entwicklung von Nanomaterialien hat in den letzten Jahren deutlich zugenommen, wobei verschiedene morphologische Strukturen unterschieden werden können: nulldimensional (0D), eindimensional (1D), zweidimensional (2D) und dreidimensional (3D). Die beliebteste 2D-Struktur, Graphen, erregte große Aufmerksamkeit für diese zweidimensionalen Architekturen, die die Entwicklung und Herstellung anderer neuer Materialien vorantrieb – Übergangsmetalldichalkogenide (TMD), graphitisches Kohlenstoffnitrid (gCN), hexagonales Bornitrid (hBN), schwarzer Phosphor (BP) und so weiter. Graphen in Form von Graphenoxid (GO) hat ein breites Anwendungspotenzial in den Bereichen Arzneimittelabgabe, Bioimaging, Biosensorik oder sogar Tissue Engineering1. Es wurde jedoch nachgewiesen, dass GO Zytotoxizität verursacht, indem es in das Zytoplasma und den Zellkern gelangt und dort zur induzierten Zellapoptose führt. Darüber hinaus reichert es sich auch im Nieren- und Lungengewebe an und ist schwer zu entfernen2,3,4. Reduziertes GO aufgrund der Änderung der amphiphilen Struktur von GO führte zu Schwierigkeiten bei der Lipidverteilung und unterdrückte die Hämolyse. Es ist klar, dass die Toxizität graphenbasierter Strukturen stark von deren Größe, funktionellen Gruppen und lateraler Größe abhängt5. Die In-vivo-Toxizitätstests belegen auch den Zusammenhang zwischen den Struktureigenschaften von Graphen und der Konzentration der Dosen und Eintrittspunkte in lebende Organismen. Im Gegensatz zu Graphenderivaten zeigen die TMD eine geringere Zytotoxizität, wenn wir ihnen menschliche Lungenepithelzellen (A549) aussetzen. MoS2, WS2 und WSe2 zeigten selbst bei hohen Konzentrationen (200 µg/ml) eine geringe Toxizität6. An Mäusen durchgeführte In-vivo-Tests zeigten, dass MoS2 biokompatibel ist und in der Tumorbehandlungstherapie eingesetzt werden kann7. MoS2 kann aufgrund seiner Kompatibilität auch als biologisch abbaubarer Biosensor8 verwendet werden. Darüber hinaus bewies eine größenabhängige Studie zur In-vitro-Biokompatibilität von graphitischem Kohlenstoffnitrid, dass 10 nm und 160 nm biokompatibel sind. Allerdings zeigte das gCN mit einer Größe von 20 nm die geringste Zelllebensfähigkeit. Das gCN agglomerierte größtenteils um die Kerne herum, drang jedoch nicht ein9. Ein weiteres Mitglied der 2D-Familie – hexagonales Bornitrid (hBN) (ca. 120 nm Durchmesser) verursachte bei niedrigen Dosen keine Lungenschäden. In anderen Organen kam es jedoch bei einer Dosis von 1600 µg/kg zu Schäden an Lunge, Leber, Niere, Herz oder Milz10. BP kann auch als erfolgreiche Alternative zu harten Medikamenten in der Chemotherapie eingesetzt werden. Es wurde dargelegt, dass BP Krebszellen abtötet (HepG2) und mit normalen Zellen biokompatibel ist (QSG-7701). Daher könnte BP als anorganisches Hilfsmittel bei der weniger schädlichen Krebsbehandlung eingesetzt werden11. Es ist klar, dass viele Faktoren (wie laterale Größe, Oberflächeneigenschaften, funktionelle Gruppen auf der Oberfläche sowie unterschiedliche Dosen) die Biokompatibilität und Toxizität von 2D-Nanomaterialien beeinflussen. Dennoch ist es wichtig, die 2D-Strukturen sowohl in In-vitro- als auch in In-vivo-Experimenten zu testen. Kürzlich entdeckte 2D-Mitglieder wie Borophen sollten sorgfältig auf ihre potenzielle Biokompatibilität oder Toxizität untersucht werden. Allerdings gibt es im Stand der Technik noch Raum für Forschung zu Borophen-Nanoflocken in ihrer ursprünglichen Form, insbesondere im Hinblick auf In-vivo-Tests.

Borophen, das erstmals 2014 erwähnt wurde, ist ein neues monoelementares 2D-Supermaterial, das aufgrund seiner hervorragenden chemischen, elektrischen, mechanischen und thermischen Eigenschaften große Aufmerksamkeit bei Forschern auf sich gezogen hat 12. Dieses neue Material wurde erstmals von zwei einzelnen Gruppen synthetisiert: Mannix et al.13 und Feng et al.14 durch Abscheidung auf dem Silbersubstrat unter UHV-Bedingungen aus einem hochreinen festen Substrat im Jahr 2015. Es gilt weithin als vielversprechendes Nanomaterial für seine potenzielle Anwendung in den Bereichen elektronische Geräte und Biomedizin15,16 ,17,18,19,20,21,22. Aufgrund seiner Materialeigenschaften und seines fluoreszierenden und photoakustischen Kontrasts für die Bildgebung sowie seiner photothermischen und photodynamischen therapeutischen Eigenschaften ist es ein vielversprechendes Material für die Arzneimittelabgabe und Theranostik21. Borophen kann mit fluoreszierenden Molekülen für die In-vitro- oder In-vivo-Fluoreszenzbildgebung funktionalisiert werden, um die Absorptionswege und die zelluläre Lokalisierung von Nanosystemen auf Borophenbasis zu verfolgen und folglich neoplastische Tumore genau zu lokalisieren23,24. Aus diesem Grund ist es notwendig, seine Wechselwirkung mit dem Organismus von Tieren und Menschen zu verstehen. Kürzlich wurde auch die antibakterielle Aktivität von Borophen-Nanoplättchen25 gegen Staphylococcus aureus, Pseudomonas aureginosa, Escherichia coli und die antimykotische Aktivität gegen Candida albicans und Aspergillus brasiliensis nachgewiesen. Allerdings ist der Mechanismus der Hemmwirkung von Borophen gegen bakterielle und pilzpathogene Mikroorganismen bisher nicht aufgeklärt25. Daher ist klar, dass der aktuelle Stand der Technik keine grundlegenden Erkenntnisse über die biologische Aktivität von Borophen in vitro und in vivo auf Zellen, Gewebe, Organe und den Organismus von Tieren liefert. Es wurde nur vermutet, dass Borophen aufgrund seiner hochreaktiven Kanten eine zytotoxische Wirkung auf Zellen ausüben könnte, was zu einer erhöhten Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) führen kann21,25.

Daher untersuchten wir in dieser Studie die In-vivo-Wirkung von Borophen-Nanoflocken auf die Lebensfähigkeit und Funktion der immunkompetenten Zellen (Hämozyten) des Insekts und ihre Fähigkeit, in diesen Zellen ROS zu produzieren. Die Tests zur Biokompatibilität von Borophen-Nanoflocken wurden am Insekt Tenebrio molitor26 durchgeführt, das ein praktisches experimentelles Modell für umfassende In-vivo-Studien der Auswirkungen von Nanopartikeln auf verschiedene physiologische Parameter darstellt, die für das Tierleben entscheidend sind27,28,29. Darüber hinaus weisen die Hämozyten von Insekten zahlreiche strukturelle und funktionelle Ähnlichkeiten mit weißen Blutkörperchen von Säugetieren auf, was ihre Untersuchung noch interessanter macht. Sowohl Insektenhämozyten als auch Säugetierleukozyten spielen eine entscheidende Rolle bei der Abwehr des Organismus gegen Krankheitserreger. Neutrophile, Makrophagen, einige dendritische Zellen von Säugetieren sowie die Plasmatozyten und Granulozyten von Insekten sind alle zur Phagozytose fähig. Sie können im Rahmen der zellulären Immunantwort Fremdpartikel wie Krankheitserreger oder Zelltrümmer verschlingen und verdauen30. Hämozyten in Insekten und bestimmte Leukozyten von Säugetieren, wie Neutrophile und Makrophagen, produzieren und setzen antimikrobielle Peptide (AMPs) frei, um Infektionen zu bekämpfen. Obwohl die spezifischen AMPs unterschiedlich sein können, bleibt die allgemeine Funktion der antimikrobiellen Abwehr erhalten. Sowohl Insekten als auch Säugetiere besitzen auf ihren Hämozyten/Leukozyten exprimierte Toll-like-Rezeptoren, die eine entscheidende Rolle bei der Erkennung konservierter molekularer Muster in Krankheitserregern spielen und Immunreaktionen auslösen30. Einige Leukozyten und Hämozyten haben auch die Fähigkeit, Immunantworten zu modulieren. Sie setzen verschiedene entzündungsfördernde Moleküle wie Zytokine und Chemokine frei, die andere Immunzellen an den Ort der Infektion oder Verletzung rekrutieren und aktivieren. Sie sind an Gewebereparatur- und Wundheilungsprozessen beteiligt, tragen zur Beseitigung von Zelltrümmern bei, fördern die Geweberegeneration und modulieren den Reparaturprozess durch die Sekretion von Wachstumsfaktoren und extrazellulären Matrixkomponenten31.

Hierbei ergaben Kurzzeituntersuchungen, dass Borophen-Nanoflocken in unterschiedlichen Dosierungen (0,5, 1 oder 2 µg Nanoflocken pro Insekt) keine Hämozytotoxizität hervorriefen. Hämozyten, die dem Vorhandensein von Borophen ausgesetzt waren, zeigten die gleiche Morphologie, Haftfähigkeit und Fähigkeit zur Bildung von Filopodien wie die Referenzhämozyten. Entscheidend ist auch, dass Borophen-Nanoflocken die Reduktionskraft von Hämozyten deutlich erhöhten, keine intrazellulären reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in Hämozyten erzeugten, das Mitochondrienmembranpotential nicht beeinträchtigten und die Phagozytose nicht beeinträchtigten.

Zunächst wurden die Bor-Massen und die synthetisierten Borophen-Flocken mittels Röntgenbeugung (XRD) untersucht, die in Abb. 1 dargestellt ist. Die Struktur der Bor-Massen besteht größtenteils aus B12-Ikosaedern, was zu unterschiedlichen Strukturen basierend auf Variationen der Grundeinheiten führt32. XRD-Diffraktogramme deuten darauf hin, dass beide Strukturen die B12-Reflexe repräsentieren – die als Grundeinheit von wenigschichtigem Borophen beschrieben werden, ~ 2Θ: 11°, 17,3°, 20,7°, 23,5°, 31°, 34,5°, 35,5°, 37° , 38,2°, 44°, 51,5°, 59°. Der sonochemische Prozess des Peelings führt zu einigen strukturellen Veränderungen. Bulk-Bor ist eine eher amorphe Struktur mit breiten, unscharfen Reflexen, bestehend aus B12; Beim Peeling werden die Reflexe schärfer und deutlicher. Es kann auch der klareren und kristallineren Struktur von Borophen ohne amorphe Phase zugeordnet werden. Die Verschiebung der Borophenreflexe zu höheren Winkelwerten kann auf die Verringerung der Gitterparameter zurückgeführt werden.

XRD-Diffraktogramm von Bulk-Bor (blau) und Borophen (dunkelgrau).

Die laterale Größe und Höhe der Borophenflocken wurden mit einem Rasterkraftmikroskop (AFM) bestimmt, das in Abb. 2 dargestellt ist.

AFM-Bild von Borophen (links) und Höhenverteilung von Borophenflocken (rechts) basierend auf AFM-Profilen.

Die Größe der Flocken betrug im Durchmesser ~ 55 bis ~ 549 nm. Allerdings waren die Höhenprofile der Borophenflocken zwischen ~ 2 und ~ 9 nm verteilt, wobei die Hauptphase ~ 4,5 nm betrug. Daher werden in dieser Forschung Borophenflocken mit einer durchschnittlichen Höhe von ~ 4,5 nm, was ~ 8 Flocken entspricht, untersucht.

Die Messung des Zetapotentials (ζ) wurde durchgeführt, um die Oberflächenladung und die Gesamtstabilität der Suspension zu bestimmen (Abb. 3, links).

Zetapotential ζ (links) und Dispersionsstabilitätsmessung (rechts) von Bor und Borophen in großen Mengen.

Zu diesem Zweck wurden homogene Suspensionen von Bor- und Borophenflocken in destilliertem Wasser mit einer Konzentration von 1 mg/ml hergestellt. Alle Messungen wurden mit dreifacher Replikation durchgeführt. Der erhaltene Wert betrug −38 ± 3,5 mV und −32,4 ± 0,7 mV für Bulk-Bor bzw. Borophen. Offensichtlich ist der ζ-Wert nach der Abblätterung gesunken (statistisch unbedeutend; p > 0,05), was darauf hindeutet, dass sich die Oberfläche von Borophen im Vergleich zur Bormasse verändert hat. Allerdings sind die Werte beider Proben typisch für eine gut stabilisierte Dispersion (für gute Stabilität ζ-Werte > 30 mV oder < -30 mV)33. Die Bilder wässriger Dispersionen von Borophenflocken und Bor in großen Mengen (Abb. 3, rechts) belegen eine gute Stabilität auch nach 24 Stunden. Eine etwas bessere Dispersion von Bor in großen Mengen kann auf einen höheren ζ-Wert und damit auf stärkere Abstoßungskräfte zurückgeführt werden. Die Stabilität der wasserbasierten Dispersion von Borophen wurde auch anhand der Absorption der Nanomateriallösung mit einer Konzentration von 1 µg/µL in 2 Stunden geschätzt und ist in Abb. 4 dargestellt. Dies beweist, dass Borophen-Nanoflocken nicht signifikant agglomerieren Dieser Zeitraum kann auf die Affinität von Borophen zu Wasser zurückgeführt werden, was mit der Messung des Zetapotentials (ζ) übereinstimmt. Die Ergebnisse zeigen, dass reine, wasserbasierte Suspensionen von Borophenflocken in unseren In-vivo-Experimenten verwendet werden können, ohne dass Stabilisatoren wie PEG hinzugefügt werden müssen, das in der Graphen-basierten Forschung an biologischen Systemen häufig verwendet wird, um die Agglomeration von Partikeln zu vermeiden.

Stabilität der Borophen-Dispersion in Wasser (1 µg/µL), basierend auf der Absorption der Lösung (Intensität des Peaks 554 nm).

Die Hämozyten von Insekten, die im offenen Kreislaufsystem von Insekten frei zirkulieren, weisen zahlreiche strukturelle und funktionelle Ähnlichkeiten mit weißen Blutkörperchen von Säugetieren auf34 und reagieren sehr empfindlich auf die Wirkung verschiedener biotischer und abiotischer Faktoren34. Aus diesem Grund sind sie ein perfektes Modell für den In-vivo-Nachweis zytotoxischer Wirkungen, die durch Nanomaterialien hervorgerufen werden27,28,29. Im aktuellen Stand der Technik gibt es zahlreiche Berichte darüber, dass Graphen-Nanomaterialien, nachdem sie mit dem Blut in den Körper gelangt sind und/oder physiologische Barrieren passiert haben, verschiedene Organe erreichen und sich dort in unterschiedlichem Ausmaß anreichern. In diesen Organen können sie durch DNA-Schäden, Autophagie und Nekrose akute und chronische Entzündungsreaktionen hervorrufen oder Zellapoptose auslösen35. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, die biologische Wirkung von Borophen als neues Mitglied der 2D-Familie zu verifizieren und die Lücke in der Forschung zu In-vivo- und In-vitro-Effekten von Borophen-Nanoflocken auf tierische und menschliche Zellen zu schließen, die bisher nicht untersucht wurde.

Um die Morphologie und Schädigung der Zellen zu beurteilen, wurden zunächst Hämozyten, die Borophen ausgesetzt waren, mittels Phasenkontrastmikroskopie (Abb. 5A, B) und Fluoreszenzmikroskopie (Abb. 5C–F) beobachtet. Die Phasenkontrastbilder von Hämozyten, die Borophen-Nanoflocken ausgesetzt waren (in einer Dosis von 2 µg Nanoflocken pro Insekt), zeigten keine Veränderungen in der Zellmorphologie. Die Nanoflocken-exponierten Hämozyten hatten die gleiche Fähigkeit, an Deckgläsern zu haften und während der Adhäsion lange Filopodien zu bilden wie Kontroll-Hämozyten (Abb. 5A, B).

Morphologie und Lebensfähigkeit der Tenebrio molitor-Hämozyten zwei Stunden nach der Injektion von Kochsalzlösung oder Borophen-Nanoflocken (bei einer Dosis von 2 µg Nanoflocken pro Insekt). Nomarskis Bilder zeigten keine Unterschiede in der Morphologie und Adhäsion von Hämozyten, die (A) Kochsalzlösung und (B) Borophen ausgesetzt waren. Mit Nanoflocken injizierte Insektenhämozyten waren ebenso in der Lage, zahlreiche und lange Filopodien zu bilden wie Kontrollzellen. Fluoreszenzmikroskopische Bilder von Kontroll- und Borophen-exponierten Hämozyten zeigten keine induzierte Apoptose in Hämozyten nach der Injektion von Kochsalzlösung (C) und Borophen-Nanoflocken (D); Die aktiven Caspasen (1–9) wurden mit SR-VAD-FMK (kein Rot = keine aktiven Caspasen) und die DNA mit DAPI (blau) gefärbt. Der MitoTracker Red CMXRos-Farbstoff (rot) wurde in den Mitochondrien von Hämozyten angesammelt, die Kochsalzlösung (E) oder Borophen-Nanoflocken (F) ausgesetzt waren, was zeigt, dass die Borophen-Nanoflocken das Mitochondrienmembranpotential nicht veränderten und die Mitochondrien aktiv waren. Maßstabsbalken: 20 µm. (G) Alamar Blue-Zellstoffwechseltest für eingebettete Hämozyten, die Borophen in einer Dosis von 0,5, 1 oder 2 µg Nanoflocken pro Insekt ausgesetzt sind. Die Daten werden als Mittelwert ± SD (n = 6) angegeben. Sternchen kennzeichnen Unterschiede zwischen Populationen (*p < 0,02, **p < 0,05).

Es ist bekannt, dass hohe Graphenkonzentrationen die Dynamik und Integrität der Plasmamembran während ihrer Internalisierung stören und folglich den Zelltod auslösen. Beispielsweise wurde gezeigt, dass die Exposition von MDA-MB-23136- und MCF-7-Brustkrebszellen, Panc-1-Bauchspeicheldrüsenkrebs37 und GLC-82-Lungenkrebs38 gegenüber hohen GO-Konzentrationen zu einem Verlust der Membranintegrität der Zellen führte Ergebnis der Einstülpung und Zerstörung der Zellmembran an der Stelle der Wechselwirkung zwischen Graphen-Nanoflocken und der Membran39. Darüber hinaus wurden die internalisierten GO-Nanoblätter in der Nähe von F-Actin-Filamenten muriner MC3T3-E1-Präosteoblasten (A) und muriner RAW-264.7-Makrophagen beobachtet. Das Vorhandensein von GO-Nanoblättern im Zytoskelett verursachte Zellzyklusveränderungen, Apoptose und oxidativen Stress in diesen Zellen40.

In unserer Arbeit wird davon ausgegangen, dass, wenn die Borophen-Nanoflocken die Integrität der Zellmembran von Hämozyten stören und sich innerhalb der F-Aktin-Mikrofilamente befinden, diese Veränderungen Apoptose in den Borophen-exponierten Hämozyten auslösen sollten. Darüber hinaus beinhaltet die Apoptose unter anderem eine DNA-Fragmentierung und die Aktivierung apoptotischer Markerenzyme, Caspasen, die zelluläre Zielproteine ​​erkennen und spalten, was zum Zelltod führt. Um eine Antwort auf diese Hypothese zu geben, wurde eine Reihe von Experimenten durchgeführt. Abbildung 5D zeigt deutlich die Fluoreszenzanalyse der Lebensfähigkeit von Hämozyten mithilfe der SR-VAD-FMK-Färbung. Es zeigte sich, dass die Borophen-Nanoflocken keine Aktivierung von Caspasen (1–9) induzierten, und die DAPI-Färbung zeigte, dass es in den Kernen der Hämozyten, die den Nanoflocken ausgesetzt waren, keine DNA-Fragmentierung gab. Diese Ergebnisse könnten darauf hindeuten, dass sich die Borophen-Nanoflocken nicht im Zytoskelett von Hämozyten ansammeln.

Aufgrund der oben beschriebenen Beobachtungen ist es äußerst interessant, die potenzielle ROS-Produktion in den Insektenhämozyten zu untersuchen, die den Borophen-Nanoflocken ausgesetzt sind. Es wurde gezeigt, dass der Hauptmechanismus der Zytotoxizität zweidimensionaler Graphenspezies oxidativer Stress ist, der das Ergebnis eines erhöhten ROS-Spiegels in der Zelle und einer durch Nanopartikel verursachten Schädigung der Zellmembran ist41,42,43,44. Die erhöhte ROS-Produktion wiederum ist einer der Hauptfaktoren, die zum apoptotischen Zelltod aufgrund von ROS-induzierter Lipidperoxidation, DNA-Schädigung und Aktivierung von Caspasen führen44,45,46,47,48. Mitochondrien gelten als Hauptquelle für ROS in Zellen44,49. Um Veränderungen im mitochondrialen Membranpotential zu erkennen, wurde ein spezifischer Fluoreszenzfarbstoff, der sich ausschließlich in aktiven Mitochondrien ansammelt, MitoTracker Red CMXRos, verwendet. Wie in Abb. 5F gezeigt, veränderten die in das Insekt injizierten Borophen-Nanoflocken (in einer Dosis von 2 µg Nanoflocken pro Insekt) das Potenzial der Mitochondrienmembran nicht, was durch die Anreicherung von Fluorochrom in Mitochondrien mit normaler Morphologie belegt wurde. Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass die Produktion von ROS in den Mitochondrien von Hämozyten bei Exposition gegenüber den in das Insekt injizierten Borophen-Nanoflocken in einer getesteten Dosis nicht erhöht wird. Anschließend wurde ein reduzierendes Reagenz, DCFH2-DA, angewendet, um zu bestätigen, dass in den Borophen-exponierten Hämozyten kein Anstieg der intrazellulären ROS-Produktion vorliegt. Es reagiert mit ROS in Zellen und wird dann zu fluoreszierendem DCF oxidiert. Diese Studie bestätigte keinen Anstieg der ROS-Werte in den Hämozyten, die den Borophen-Nanoflocken bei einer Dosis von 0,25, 0,5, 1 oder 2 µg Nanoflocken pro Insekt ausgesetzt waren (Abb. 6C–F), im Vergleich zur Kontrolle (Abb. 6A). Andererseits war die ROS-Produktion in Hämozyten, die Wasserstoffperoxid ausgesetzt waren, deutlich erhöht (Abb. 6B). Ein weiterer Indikator für die Lebensfähigkeit von Zellen, alamarBlue, ist ideal dafür konfiguriert, Oxidation in der gesamten mitochondrialen Elektronentransportkette zu erkennen. Deshalb haben wir ihn verwendet, um das Überleben von Hämozyten zu untersuchen, die steigenden Dosen von Borophen-Nanoflocken (0,5, 1 oder 2 µg Nanoflocken pro Tag) ausgesetzt waren Insekt) und um das Fehlen einer Zytotoxizität von Borophen-Nanoflocken in Hämozyten zu bestätigen (Abb. 5G). Diese Studie zeigte einen dosisabhängigen Anstieg der natürlichen Reduktionskraft von Hämozyten, die steigenden Dosen von Borophen-Nanoflocken ausgesetzt waren, was eine Steigerung der Lebensfähigkeit der Borophen-exponierten Hämozyten im Vergleich zur Kontrolle demonstrierte.

Intrazelluläre ROS-Produktion in den Tenebrio molitor-Hämozyten 1 Stunde nach einer Injektion von Kochsalzlösung (A), einer Injektion von 40 nM Wasserstoffperoxid (B), einer Injektion von 0,25 (C), 0,5 (D), 1 (E) oder 2 µg (F). ) von Borophen-Nanoflocken pro Insekt. Die Intensität der grünen Fluoreszenz von DCF zeigt die ROS-Konzentration in den Wasserstoffperoxid-exponierten Hämozyten an (Positivkontrolle). Die DCFH2-DA-Färbung von Hämozyten, die Kochsalzlösung (Negativkontrolle) oder Borophen-Nanoflocken in den getesteten Dosen ausgesetzt waren, zeigte keine ROS-Erzeugung in diesen Zellen. Maßstabsbalken: 20 µm.

Es wurde gezeigt, dass die Internalisierung der Graphen-Nanomaterialien in Zellen stark von der Partikelgröße abhängt; Die proteinbeschichteten GO-Nanoblätter großer und kleiner Größe wurden von Zellen hauptsächlich durch Phagozytose bzw. Clathrin-vermittelte Endozytose aufgenommen50. Die zellulären Prozesse, die die Phagozytose vermitteln, werden durch verschiedene molekulare Mechanismen und biophysikalische Auswirkungen des Aufbaus und Umbaus des Zytoskeletts in der Phagozytenmembran gesteuert51. Hier lag die laterale Größe der in den Experimenten verwendeten Borophen-Nanoflocken im Bereich von ~ 55 bis ~ 550 nm und ihre Dicke betrug ~ 4,5 nm (Abb. 4). Als die Alexa Fluor 647-Borophen-Nanoflocken-Lösung in das Hämocoel des Insekts injiziert wurde, Die fluoreszierenden Nanoflocken wurden effektiv im Zytoplasma von Hämozyten phagozytiert und aggregiert (Abb. 7B), im Gegensatz zu Hämozyten von Kontrollinsekten, denen nur Kochsalzlösung injiziert wurde (Abb. 7A). Anschließend wird in dem Experiment, das den Einfluss der Borophen-Nanoflocken auf die Phagozytose eines anderen abiotischen Ziels zeigt, gezeigt, dass diese Nanoflocken (bei allen getesteten Dosen) die Phagozytose von Latexkügelchen nicht beeinträchtigten (Abb. 7C–G).

Phagozytische Aktivität der Tenebrio molitor-Hämozyten, die Kochsalzlösung (A) und 2 µg Alexa Fluor 647-Borophen (B) ausgesetzt oder Kochsalzlösung (C), 0,5 (D), 1 (E) und 2 µg (F) Borophen ausgesetzt waren und dann mit fluoreszierenden Latexkügelchen injiziert. Repräsentative Fluoreszenzmikroskopbilder zeigen Hämozyten, die mit klebender Kochsalzlösung oder Alexa Fluor 647-Borophen exponiert waren und mit Oregon Green 488-Phalloidin gefärbt wurden, um das F-Aktin-Zytoskelett sichtbar zu machen, und DAPI zur Visualisierung von DNA (A, B), Alexa Fluor 647-Borophen-Nanoflocken (rot). von Hämozyten umgeben, die durch weiße Pfeile (B) angezeigt werden. Repräsentative Mikroskopbilder von Nomarski zeigen die Phagozytose fluoreszierender Latexkügelchen durch Hämozyten von Insekten, denen Kochsalzlösung und Borophen-Nanoflocken injiziert wurden (D–F). Schwarze Pfeile zeigen Phagozyten mit fluoreszierenden Latexkügelchen (grün). Maßstabsbalken: 20 µm. (G) Der Prozentsatz der mit Kochsalzlösung und Borophen exponierten Hämozyten, die Latexkügelchen enthielten, wurde gemessen (Mittelwert ± SEM, Student-t-Test).

Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Nanoflocken während der Phagozytose der Borophen-Nanoflocken oder der Phagozytose der Latexkügelchen durch Hämozyten, die zuvor den Borophen-Nanoflocken ausgesetzt waren, den Umbau des Zytoskeletts und die Bildung von Filopodien, die notwendige Vorläufer der Phagosomenbildung sind, nicht beeinträchtigen51. Das Fehlen von Veränderungen in der Lebensfähigkeit der Nanoflocken-exponierten Hämozyten, ihre Fähigkeit, während der Adhäsion lange Filopodien zu bilden und die Latexkügelchen zu phagozytieren, bestätigen unsere Hypothese über die Nichtakkumulation der Borophen-Nanoflocken im F-Aktin-Netzwerk, das das bildet Zytoskelett der Hämozyten. Interessanterweise steht dies im Widerspruch zur Graphen-basierten Forschung. Es wird berichtet, dass GO in Mikrogröße viel stärkere Entzündungsreaktionen hervorrief, während Graphenschichten in Nanogröße eine bessere Biokompatibilität in Makrophagen zeigten52. Eine andere Studie zeigte, dass Graphen nach der Internalisierung im Zytoplasma, im perinukleären Raum und im Zellkern von Mausmakrophagen akkumuliert wurde, was Zytotoxizität auslöste, indem es (1) den intrazellulären ROS erhöhte, (2) das mitochondriale Membranpotential verringerte und (3) Apoptose durch Aktivierung des mitochondrialen Signalwegs induzierte53. Unsere früheren Studien an T. molitor zeigten wiederum, dass die Injektion oder topische Anwendung von Nanodiamanten oder den hydroxylfunktionalisierten exfolierten hexagonalen Bornitrid-Nanoflocken (h-BN-OH-n) ebenfalls keinen Einfluss auf die Adhäsion, Lebensfähigkeit und die komplexe Funktion der Zelle hatte Membran von Hämozyten und beeinträchtigte nicht die Phagozytose von Latexkügelchen. Der Langzeit-Immunoassay zeigte jedoch, dass h-BN-OH-n die Knötchenbildung im Hämocoel von Insekten nach einer bakteriellen Belastung beeinträchtigte, was auf die durch h-BN-OH vermittelte Abnahme der Fähigkeit von Hämozyten, Bakterien zu erkennen, zurückzuführen ist. wandern zu ihnen oder bilden um sie herum Makroaggregate27,28. Dieses Ergebnis legt nahe, dass eine Langzeitstudie der Immunantwort der Borophen-exponierten Hämozyten notwendig ist, um eine vollständige Antwort auf die In-vivo-Biokompatibilität dieses Nanomaterials zu erhalten.

Zusammenfassend schließen wir die Lücke in der Forschung zur In-vivo-Wechselwirkung von 2D-Borophen-Nanoflocken mit Hämozyten des T. molitor-Käfers und zeigen, dass das Nanomaterial in Kurzzeitstudien bei Dosen von 0,5, 1 oder 2 µg Nanoflocken pro Stück keine Hämozytotoxizität induziert Insekt. Es wurde festgestellt, dass die Morphologie, die Adhäsionsfähigkeit, die Fähigkeit zur Bildung langer Filopodien und die Lebensfähigkeit der Zellen mit denen der Kontrollhämozyten identisch waren. Darüber hinaus deuten die Ergebnisse darauf hin, dass Borophen-Nanoflocken die Reduktionskraft von Hämozyten erhöhten und keine intrazellulären reaktiven Sauerstoffspezies in Hämozyten erzeugten oder das Mitochondrienmembranpotential beeinträchtigten. Der Test der immunologischen Aktivität von Hämozyten zeigte, dass die Nanoflocken keinen Einfluss auf die Phagozytose hatten. Daher präsentiert dieser Beitrag neue Einblicke in die Gruppe der 2D-Materialien, die aufgrund ihrer besonderen Struktur und einzigartigen Eigenschaften zu den vielversprechendsten Materialien für biomedizinische Anwendungen zählen. Allerdings sind noch langfristige In-vivo-Studien an Insekten und anderen Tiermodellen erforderlich, um zweifelsfrei zu bestätigen, dass 2D-Borophen biokompatibel und ein biologisch sicheres neues Nanomaterial für den Einsatz in Industrie und Medizin ist.

Borpulver (B, CAS: 7440-42-8) wurde von Sigma Aldrich (USA) bezogen.

Das Zetapotential wurde auf einem Zeta Sizer (ZS Nano ZEN 3600, Malvern) gemessen, um das Oberflächenpotential zu bestimmen. Rasterkraftmikroskopie [AFM MultiMode 8 (Bruker)] liefert Informationen über die Dicke und Gittergröße von abgeblätterten Materialien. Die Analyse der Phasenzusammensetzung und Kristallinität der Materialien wurde mit einem Aeris-Diffraktometer (Malvern Panalytical) und Cu-Kα-Strahlung (λ = 1,544 Å) durchgeführt. Die UV-Vis-Messung wurde mit einem Spektrometer von Jasco (Japan) durchgeführt.

Das Borophen wurde aus Bor in großen Mengen mithilfe einer an anderer Stelle vorgestellten sonochemischen Methode synthetisiert54. Kurz gesagt wurden 300 mg Bor in 80 ml Aceton dispergiert und 24 Stunden lang unter einer Ultraschallsonotrode (Sonics&Materials, 20 kHz) gehalten. Danach wurde die Lösung 3 Minuten lang bei einer Geschwindigkeit von 5000 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde gesammelt und zunächst 6 Stunden bei 60 °C und 12 Stunden bei 100 °C in einem Vakuumtrockner getrocknet.

Um zu zeigen, dass Borophen-Nanoflocken von Hämozyten aufgenommen werden können, wurde das Nanomaterial mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert. Es wurde eine Lösung von 1 µg/ml Alexa Fluor 647 (Thermo Fisher Scientific) in Dimethylformamid (DMF, Sigma Aldrich) hergestellt. 10 mg Borophen wurden mit 10 ml Alexa Fluor 647 gemischt. Nach 24 Stunden wurde das Material zentrifugiert (5 Minuten bei 5000 U/min), in DMF und Wasser gewaschen und über Nacht bei 35 °C getrocknet.

Das Borophen oder das Alexa Fluor 647-Borophen wurde in physiologischer Kochsalzlösung für Tenebrio gelöst, um Stammlösungen von 1 mg/ml zu ergeben. Die vorbereiteten Stammlösungen wurden bei –30 °C gelagert und die Arbeitslösungen wurden kurz vor der Verwendung in physiologischer Kochsalzlösung zubereitet. Die Borophenlösungen mit unterschiedlichen Konzentrationen wurden vor der Verwendung 15 Minuten lang bei 80 W beschallt, um mögliche Aggregate zu vermeiden.

Eine Stammkultur von T. molitor wurde am Institut für Tierphysiologie und Entwicklungsbiologie des Instituts für Experimentelle Biologie der Adam-Mickiewicz-Universität in Posen, Polen, gepflegt. Alle in unseren Experimenten verwendeten Käfer stammten von Eltern, die weniger als einen Monat alt waren. Die Kontroll- und Versuchsgruppen wurden in getrennten Plastikboxen in einer Klimakammer bei einer konstanten Temperatur von 26 °C, einer relativen Luftfeuchtigkeit von 60 ± 5 % und einer Photoperiode von 12 Stunden Licht und 12 Stunden Dunkelheit gehalten. Die Experimente wurden für jede Behandlung an fünfzehn 4 Tage alten erwachsenen Insekten durchgeführt. Den Insekten wurde eine Borophen-Nanoflockenlösung in einer Dosis von 2 µg Nanoflocken pro Insekt injiziert (Hämozytenadhäsion, Hämozytenapoptose, Test auf aktive Mitochondrien, Phagozytose von Alexa Fluor 647-Borophen-Nanoflocken), 0,5, 1 oder 2 µg Nanoflocken pro Insekt ( Phagozytose der Latexkügelchen und AlamarBlue-Assay) und 0,25, 0,5, 1 oder 2 µg Nanoflocken (ROS-Assay).

Die 4 Tage alten Käfer wurden mit CO2 betäubt, in destilliertem Wasser gewaschen und mit 70 %igem Ethanol desinfiziert. Mit einer Hamilton-Spritze (Hamilton Co., Bonaduz, Schweiz) wurde eine Borophen-Nanoflocken-Lösung (2 µl, in einer Dosis von 2 µg pro Insekt) durch die Bauchmembran zwischen dem zweiten und dritten Abdomensegment in Richtung Kopf injiziert. Den Kontrollinsekten wurde das gleiche Volumen physiologischer Kochsalzlösung injiziert. Alle Injektionen wurden unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Vor der Hämolymphensammlung wurden die Käfer erneut mit CO2 betäubt, in destilliertem Wasser gewaschen und mit 70 %igem Ethanol desinfiziert. Sowohl Kontrollinsekten als auch mit Borophen injizierte Insekten wurden drei Stunden nach der Injektion entnommen und die Hämozyten wurden präpariert. Kurz gesagt, Hämolymphproben (5 µl) wurden mit „End-to-End“-Mikrokapillaren (Drummond Scientific, Broomall, PA, USA) gesammelt, nachdem ein Tarsus von einem Vorderbein abgeschnitten wurde. Hämolymphe wurde in 20 µl eiskalter physiologischer Kochsalzlösung mit gerinnungshemmendem Puffer (4,5 mmol L−1 Zitronensäure und 9 mmol L−1 Natriumcitrat) im Verhältnis 5:1 v/v verdünnt. Die Hämolymphe der Kontrolle und der mit Nanoflocken injizierten Insekten wurde auf mit Alkohol gereinigte Deckgläser getropft, die mit 7 µl 0,01 % Poly-L-Lysin (Sigma P4707, St. Louis, MO, USA) beschichtet waren. Man ließ die Hämozyten absetzen (15 Minuten bei Raumtemperatur) und entfernte dann die restliche Flüssigkeit. Die abgesetzten Zellen wurden zweimal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und 15 Minuten in Kochsalzlösung inkubiert. Die Fixierung wurde in 4 % Paraformaldehyd erreicht. Die Hämozyten wurden mit einem Nikon Eclipse TE 2000-U-Fluoreszenzmikroskop mit Nomarski-Optik untersucht, um die Hämozytenadhäsion zu untersuchen. Die Bilder wurden mit einer Nikon DS-1QM-Digitalkamera dokumentiert.

Die Zytotoxizität von Borophen wurde an Insektenhämozyten mithilfe eines Hämozyten-Bioassays in vivo wie zuvor beschrieben bewertet55. Kurz gesagt, die erwachsenen Käfer wurden in vier Versuchsgruppen aufgeteilt – darunter eine mit Kochsalzlösung behandelte Kontrollgruppe und drei mit Borophen behandelte Gruppen. Den experimentellen Käfergruppen wurde die Borophenlösung (2 µL) in einer Dosis von 0,5, 1 bzw. 2 µg Nanoflocken pro Insekt mit einer Hamilton-Spritze (Hamilton Co., Bonaduz, Schweiz) injiziert, während der Kontrollgruppe Käfern wurde die gleiche Menge Kochsalzlösung injiziert. Eine Stunde nach der Injektion wurden Hämolymphproben (5 µl) entnommen; Die Hämozyten wurden zum Nachweis von aktiver Caspase unter Verwendung eines Inhibitors der Caspase (1–9)-Aktivität (ein Sulforhodaminderivat des Valylalanylasparaginsäurefluormethylketons, SR-VAD-FMK; AK-115, BIOMOL, Plymouth Meeting, PA, USA) und Visualisierung von Hämozytenkernen mittels DAPI. Die Hämozyten wurden mit einem Nikon Eclipse TE 2000-U-Fluoreszenzmikroskop auf Apoptosenachweis untersucht und die Bilder mit einer Nikon DS-1QM-Digitalkamera dokumentiert.

MitoTracker Red CMXRos (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) ist ein roter Fluoreszenzfarbstoff, der Mitochondrien in lebenden Zellen färbt. Den betäubten und desinfizierten 4 Tage alten Versuchskäfern wurde die Borophenlösung (2 µL) in einer Dosis von 2 µg Nanoflocken pro Insekt injiziert, während der Kontrollgruppe der Käfer das gleiche Volumen Kochsalzlösung injiziert wurde. Dann wurde 20 Minuten nach der Injektion beiden Käfergruppen 1 µM MitoTracker Red CMX Ros-Lösung (2 µL) injiziert und 40 Minuten nach der Inkubation wurden die Hämolymphproben gesammelt und die Hämozyten auf mit Alkohol gereinigte Deckgläser gelegt, die mit 7 µL 0,01 % beschichtet waren. Poly-L-Lysin für 15 Minuten, mit Kochsalzlösung gewaschen, mit 100 nM MitoTracker Red CMX Ros-Lösung für 40 Minuten inkubiert, mit Kochsalzlösung gewaschen und in 4 % Paraformaldehyd fixiert. Die Hämozyten wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop Nikon Eclipse TE 2000-U auf den Nachweis von Mitochondrien untersucht und die Bilder mit einer Digitalkamera Nikon DS-1QM dokumentiert.

Hämolymphe (3 μl) von Insekten, denen 2 μl Nanoflockenlösung in einer Dosis von 0, 5, 1 oder 2 μg Borophen pro Insekt injiziert worden war, wurde 1 Stunde nach der Injektion gesammelt und in 27 μl gerinnungshemmender Lösung verdünnt. Dann wurden 5 µl verdünnte Hämolymphe mit 5 µl Trypanblau-Lösung 0,4 % (Sigma-Aldrich) gemischt, um die Anzahl der Hämozyten in 1 µl Hämolymphe unter Verwendung von LUNA-II (Logos Biosystems Inc.) zu messen. Die Lebensfähigkeit der Hämozyten wurde mit dem alamarBlue-Assay (Invitrogen) unter Verwendung einer auf Resazurin basierenden Lösung gemessen, die als Indikator für die Zellgesundheit fungiert, indem sie die Reduktionskraft lebender Zellen nutzt, um die Lebensfähigkeit quantitativ zu messen. Hämolymphsonden (10 µl) wurden in einer Nunclon-Delta-Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen (schwarzer, flacher Boden) (Thermo Fisher) ausplattiert und mit AlamarBlue-Lösung versetzt und 4 Stunden lang inkubiert (37 °C, 5 % CO2). Beim Eindringen in lebende Zellen wird Resazurin zu Resorufin reduziert, einer rot gefärbten und stark fluoreszierenden Verbindung. Die Fluoreszenzintensität wurde mit einem aparaten Mikroplatten-Spektrofluorometer – Tecan Infinite 200 PRO (Tecan AG) bei einer Anregung von 530 nm und einer Emission von 590 nm abgelesen. Die Fluoreszenzintensität jeder Hämolymphsonde wurde für 1000 Hämozyten berechnet.

Die intrazellulären ROS-Spiegel wurden unter Verwendung von 2′,7′-Dichlordihydrofluoresceindiacetat (DCFH2-DA) untersucht, das durch unspezifische Esterasen gespalten wird, um 2′,7′-Dichlordihydrofluorescein (DCFH2) zu erzeugen, und durch ROS quantitativ oxidiert wird, um fluoreszierendes 2′ zu erzeugen. 7′-Dichlorfluorescein (DCF)56. In der vorliegenden Studie wurde den 4 Tage alten Käfern die Borophen-Nanoflockenlösung (2 µL) in einer Dosis von 0,25, 0,5, 1 oder 2 µg Nanoflocken pro Insekt injiziert, während der Kontrollgruppe der Käfer diese injiziert wurde gleiches Volumen Kochsalzlösung oder 40 nM H2O2-Lösung. Eine Stunde nach der Injektion von Kochsalzlösung, H2O2-Lösung oder Nanoflocken wurden die Hämolymphproben (2 µL) gesammelt und die Hämozyten vorbereitet und für den ROS-Nachweis verwendet. Zu diesem Zweck wurden die Hämozyten 20 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln mit 10 µM 2′,7′-Dichlorfluoresceindiacetat (DCFH-DA) gefärbt. Die Bildgebung lebender Zellen wurde mit einem Nikon Eclipse TE 2000-U-Fluoreszenzmikroskop durchgeführt. Die Bilder wurden mit einer Nikon DS-1QM Digitalkamera aufgenommen.

Ein In-vivo-Phagozytose-Bioassay wurde verwendet, um die Fähigkeit von Hämozyten zu zeigen, die Borophen-Nanoflocken zu verschlingen. Im ersten Experiment wurde fluoreszierendes, mit Alexa Fluor 647 markiertes Borophen verwendet, um zu untersuchen, ob diese Nanoflocken nach ihrer Injektion in die Hämolymphe des Insekts von Hämozyten phagozytiert werden. Vier Tage alte T. molitor-Käfer wurden in die Kontrollgruppe und die Versuchsgruppe aufgeteilt und vor der Behandlung mit Kochsalzlösung oder Alexa Fluor 647-Borophen betäubt, mit 70 % Ethanol desinfiziert und in destilliertem Wasser gewaschen. Der Kontrollgruppe der Käfer wurden 2 µL physiologische Kochsalzlösung injiziert, während der Versuchsgruppe 2 µL Alexa Fluor 647-Bophen-Lösung injiziert wurden, wobei pro Insekt eine Dosis von 2 µg Alexa Fluor 647-Bophen-Nanoflocken verabreicht wurde. Den Insekten wurde eine Stunde nach der Injektion Hämolymphe entnommen. Die Verfahren zur Injektion, Hämolymphensammlung und Hämozytenpräparation wurden gemäß den zuvor beschriebenen Methoden durchgeführt29. Um das F-Aktin sichtbar zu machen, wurden die Hämozyten mit Oregon Green 488-Phalloidin (ThermoFisher Scientific) gefärbt, und um die Zellkerne sichtbar zu machen, wurden die Zellen mit DAPI-Lösung (Sigma-Aldrich) gefärbt. Die Hämozytenpräparate wurden unter einem Nikon Eclipse TE 2000-U-Fluoreszenzmikroskop untersucht, um das Vorhandensein von Alexa Fluor 647-Borophen-Nanoflocken im Inneren der Hämozyten festzustellen. Jede Versuchsgruppe bestand aus fünfzehn Insekten.

Gleichzeitig mit demselben Biotest untersuchten wir, ob die Hämozyten nach der Phagozytierung der Borophen-Nanoflocken die Fähigkeit behalten, ein weiteres abiotisches Ziel zu phagozytieren – die fluoreszierenden Latexkügelchen27. Kurz gesagt, erwachsene Käfer wurden in vier Versuchsgruppen aufgeteilt – darunter die mit Kochsalzlösung behandelte Kontrollgruppe und drei mit Borophen behandelte Gruppen. Alle Insekten wurden anästhesiert und der Kontrollgruppe wurde physiologische Kochsalzlösung (2 µL) injiziert, der ersten Versuchsgruppe wurde die Borophen-Nanoflockenlösung (2 µL) in einer Dosis von 0,5 µg Nanoflocken pro Insekt injiziert, der zweiten Gruppe wurde die Borophen-Nanoflockenlösung (2 µL) injiziert Injiziert wurde eine Borophen-Nanoflockenlösung (2 µl) in einer Dosis von 1 µg Nanoflocken pro Insekt und die dritte Gruppe erhielt eine Injektion von 2 µg Borophen-Nanoflocken pro Insekt. Eine Stunde nach der Exposition gegenüber Kochsalzlösung und Nanoflocken wurden die Insekten erneut betäubt, desinfiziert und mit 2 µL der fluoreszierenden Latexkügelchensuspension (verdünnt im Verhältnis 1:1000 v/v in steriler Kochsalzlösung; Sigma-Aldrich L1030) injiziert. Eine Stunde nach der Latexkügelcheninjektion wurden Hämolymphproben (5 µL) entnommen und die Hämozyten vorbereitet. Die Hämozyten wurden mit Kochsalzlösung gewaschen und 10 Minuten lang mit 4 % Paraformaldehyd fixiert. Anschließend wurden die Hämozyten erneut gewaschen, montiert und mit einem Nikon Eclipse TE 2000-U-Fluoreszenzmikroskop mit Nomarski-Optik untersucht. Pro Glasobjektträger wurden fünf Sichtfelder zufällig ausgewählt und der Prozentsatz der Hämozyten, die fluoreszierende Latexkügelchen verschlungen hatten, berechnet. Jede Versuchsgruppe bestand aus fünfzehn Insekten.

Alle Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Statistische Analysen wurden mithilfe eines Student-t-Tests (Graphpad Prism 7.0, San Diego, CA, USA) durchgeführt. P-Werte unter 0,05 galten als statistisch signifikante Unterschiede zwischen den verglichenen Gruppen.

Die während der aktuellen Studie verwendeten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim jeweiligen Autor erhältlich.

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Diese Arbeit wurde vom Nationalen Wissenschaftszentrum Polen [NCN] unter der Fördernummer OPUS21 (2021/41/B/ST5/03279) unterstützt.

Abteilung für Tierphysiologie und Entwicklungsbiologie, Institut für Experimentelle Biologie, Fakultät für Biologie, Adam-Mickiewicz-Universität in Posen, Uniwersytet Poznańskiego Str. 6, 61-614, Posen, Polen

Elżbieta Czarniewska

Fakultät für Chemische Technologie und Ingenieurwesen, Abteilung für Nanomaterialien-Physikochemie, Westpommersche Technische Universität, Stettin, Piastow Ave. 42, 71-065, Stettin, Polen

Krzysztof Sielicki, Klaudia Maślana und Ewa Mijowska

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EC entwarf und führte die biologischen Experimente durch, interpretierte die biologischen Daten, erstellte und überprüfte das Manuskript, KS und KM führten die Synthese und physikalisch-chemische Analyse durch, erstellten das Manuskript, EM entwarf die Charakterisierung des Materials und erstellte und überprüfte das Manuskript. Alle Autoren stimmten dem endgültigen Manuskript zu.

Korrespondenz mit Elżbieta Czarniewska oder Ewa Mijowska.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Czarniewska, E., Sielicki, K., Maślana, K. et al. In-vivo-Studie zur Wechselwirkung von Borophen-Nanoflocken mit dem Käfer Tenebrio molitor: Lebensfähigkeit von Hämozyten und kurzfristige Immunitätswirkung. Sci Rep 13, 11823 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-38595-8

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Eingegangen: 10. Januar 2023

Angenommen: 11. Juli 2023

Veröffentlicht: 21. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-38595-8

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